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液相色譜柱的選擇(ze)方法概述

選擇方(fang)法一(yi)：填料(liao)的種類(lei)

填料的基質一般選擇使用多(duo)(duo)孔硅膠或聚合(he)物(wu)等，在細孔的表面有多(duo)(duo)種經過化學(xue)修飾的官能團。

利(li)用目(mu)標(biao)成分(fen)(fen)(fen)疏(shu)水性的(de)(de)不(bu)同(tong)起到分(fen)(fen)(fen)離(li)效(xiao)果的(de)(de)反(fan)相分(fen)(fen)(fen)離(li)模式(shi)(shi)，利(li)用極性不(bu)同(tong)進行分(fen)(fen)(fen)離(li)的(de)(de)正相分(fen)(fen)(fen)離(li)模式(shi)(shi)，根據(ju)分(fen)(fen)(fen)子(zi)大小的(de)(de)不(bu)同(tong)而分(fen)(fen)(fen)離(li)的(de)(de)尺寸排阻模式(shi)(shi)，根據(ju)離(li)子(zi)性質的(de)(de)不(bu)同(tong)而達到分(fen)(fen)(fen)離(li)的(de)(de)離(li)子(zi)交換模式(shi)(shi)，又或者分(fen)(fen)(fen)離(li)光(guang)學異構(gou)體(ti)等，根據(ju)目(mu)的(de)(de)的(de)(de)不(bu)同(tong)，需要

選擇對應的(de)填料。

作(zuo)為填(tian)充劑(ji)的代表(biao)十八(ba)烷基、辛(xin)基、丁(ding)基等即在硅膠的細孔表(biao)面化學鍵合的 C18（ODS）、C8 或 C4 等，碳(tan)鏈越長，疏水(shui)性（保留能力）越強。

選擇方(fang)法二：填料孔徑

多孔(kong)(kong)硅(gui)膠為基(ji)體的(de)(de)(de)(de)填料表面具有(you)無數的(de)(de)(de)(de)細孔(kong)(kong)，需要(yao)根據(ju)目(mu)的(de)(de)(de)(de)成分(fen)的(de)(de)(de)(de)分(fen)子(zi)(zi)量選(xuan)擇對(dui)應大小(xiao)的(de)(de)(de)(de)填料孔(kong)(kong)徑。微(wei)孔(kong)(kong)徑 100Å（10nm）對(dui) 應 5000 左右 的(de)(de)(de)(de) 分(fen) 子(zi)(zi) 量。 分(fen) 子(zi)(zi) 量 大 于(yu) 5000 的(de)(de)(de)(de)， 可(ke) 以 選(xuan) 擇300Å（30nm）或以上的(de)(de)(de)(de)大孔(kong)(kong)徑柱子(zi)(zi)。目(mu)的(de)(de)(de)(de)成分(fen)能(neng)(neng)夠進入孔(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)話，才能(neng)(neng)與官能(neng)(neng)團相(xiang)互作(zuo)用從(cong)而起到分(fen)離的(de)(de)(de)(de)效果(guo)(guo)。對(dui)于(yu)大分(fen)子(zi)(zi)蛋白質(zhi)或聚合物等高分(fen)子(zi)(zi)，如果(guo)(guo)不(bu)是大孔(kong)(kong)徑的(de)(de)(de)(de)基(ji)體，與官能(neng)(neng)團的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用就會減少。另外，分(fen)析低分(fen)子(zi)(zi)時(shi)，選(xuan)擇太大的(de)(de)(de)(de)微(wei)孔(kong)(kong)，由于(yu)會擴散故導致峰型可(ke)能(neng)(neng)會展寬(kuan)。

選擇方法三：填(tian)料粒(li)徑

一(yi)(yi)般 HPLC 多使(shi)用粒(li)徑(jing)為(wei) 5μm 的球狀(zhuang)硅膠，近年來也逐(zhu)步開始使(shi)用 2μm 以(yi)下的微(wei)(wei)粒(li)子(zi)，粒(li)徑(jing)越(yue)(yue)小(xiao)色譜(pu)柱(zhu)理(li)論(lun)塔板數(shu)就越(yue)(yue)高，得(de)到峰(feng)型(xing)也就越(yue)(yue)尖銳，分(fen)(fen)離越(yue)(yue)好(hao)。而且，粒(li)徑(jing)越(yue)(yue)小(xiao)，即使(shi)流速(su)上升，理(li)論(lun)塔板數(shu)降低很少(shao)，微(wei)(wei)粒(li)子(zi)色譜(pu)柱(zhu)越(yue)(yue)來越(yue)(yue)適(shi)合快(kuai)速(su)分(fen)(fen)析(xi)。但是，微(wei)(wei)粒(li)子(zi)使(shi)用時，必(bi)須注意使(shi)用壓力。3μm 以(yi)下適(shi)合UHPLC快(kuai)速(su)分(fen)(fen)析(xi)，3 ～ 5μm 適(shi)合一(yi)(yi)般的 HPLC 柱(zhu)分(fen)(fen)析(xi)，10μm 則作為(wei)制備(bei) HPLC 柱(zhu)使(shi)用。

選擇方法四(si)：色譜柱尺寸 （長度）

一般(ban)使用較多的(de)色譜柱(zhu)(zhu)(zhu)的(de)長(chang)度(du)，通(tong)用型，制備 HPLC 柱(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)度(du)為150 ～ 250mm，LC/MS 為 100-150mm，超快速(su) HPLC（UHPLC）為 50-100mm。色譜柱(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)度(du)越長(chang)理論塔(ta)板(ban)數也越高。只是，需要注意，色譜柱(zhu)(zhu)(zhu)長(chang)度(du)加(jia)倍后(hou)，分析時(shi)間與使用壓力也會(hui)加(jia)倍。

對于 2μm 或者 3μm 的微粒子，分離度(du)和理(li)論塔板數都較好時(shi)，將色(se)譜柱(zhu)的長度(du)變短，可(ke)以縮短分析(xi)(xi)時(shi)間，進行快速分析(xi)(xi)。

選擇方法五：色譜柱尺寸 （內(nei)徑）

一般通用(yong)的(de) HPLC 柱內(nei)(nei)徑(jing)(jing)為 4.6mm，LC/MS 內(nei)(nei)徑(jing)(jing)多(duo)為 2.1mm，毛(mao)(mao)細管(guan) HPLC 色(se)譜柱為不(bu)(bu)滿(man) 1mm，制備(bei) HPLC 色(se)譜柱6.0mm 以上。通用(yong) HPLC 系列，內(nei)(nei)徑(jing)(jing)不(bu)(bu)同(tong)(tong)得到的(de)結果也不(bu)(bu)同(tong)(tong)。即(ji)使(shi)改(gai)變(bian)內(nei)(nei)徑(jing)(jing)，根據(ju)色(se)譜柱的(de)截面積比(bi)改(gai)變(bian)相應(ying)的(de)流速，保留(liu)時間基本不(bu)(bu)會改(gai)變(bian)。特別是(shi)對(dui)(dui)于像 UV、RI 一樣對(dui)(dui)于濃度要求很(hen)高(gao)的(de)檢測器而言，流速越小(xiao)，其對(dui)(dui)應(ying)的(de)靈敏度也越高(gao)。需要注意的(de)是(shi)，通用(yong)型 HPLC 色(se)譜柱內(nei)(nei)徑(jing)(jing)太(tai)小(xiao)，裝(zhuang)置的(de)死體積（管(guan)路內(nei)(nei)多(duo)余的(de)配(pei)管(guan)或者流通池容量(liang)）影響變(bian)大，峰型會變(bian)寬。并且(qie)根據(ju) HPLC 系統使(shi)用(yong)目的(de)的(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)（分析、制備(bei)、毛(mao)(mao)細管(guan)等(deng)）種類也不(bu)(bu)同(tong)(tong)，能夠設定的(de)正確(que)的(de)流速與流速范圍，系統響應(ying)等(deng)也會不(bu)(bu)同(tong)(tong)，所(suo)以根據(ju)系統不(bu)(bu)同(tong)(tong)選(xuan)擇對(dui)(dui)應(ying)的(de)內(nei)(nei)徑(jing)(jing)是(shi)十分重要的(de)。

選(xuan)擇方法六：端(duan)基封尾

端(duan)(duan)基(ji)(ji)(ji)(ji)封(feng)尾(wei)是硅(gui)膠表面有(you)一(yi)種被稱為硅(gui)醇(chun)基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)弱酸(suan)性官(guan)能團(tuan)（Si-OH）存在。作為反相(xiang)分配填料等(deng)合(he)成(cheng)時，利用(yong)硅(gui)醇(chun)基(ji)(ji)(ji)(ji)對十八烷基(ji)(ji)(ji)(ji)（ODS：C18）進(jin)行(xing)化(hua)學鍵合(he)。然而，部(bu)分沒有(you)鍵合(he)殘(can)留(liu)的(de)硅(gui)醇(chun)基(ji)(ji)(ji)(ji)會(hui)與堿性化(hua)合(he)物吸附(fu)，引起峰拖(tuo)尾(wei)。為了(le)防止這種現象，使用(yong)甲基(ji)(ji)(ji)(ji)等(deng)短鏈(lian)基(ji)(ji)(ji)(ji)團(tuan)對殘(can)存硅(gui)醇(chun)基(ji)(ji)(ji)(ji)進(jin)行(xing)處理，這個(ge)過(guo)程就稱作端(duan)(duan)基(ji)(ji)(ji)(ji)封(feng)尾(wei)。選擇 ODS 色譜柱(zhu)(zhu)時，請選擇進(jin)行(xing)端(duan)(duan)基(ji)(ji)(ji)(ji)封(feng)尾(wei)的(de)柱(zhu)(zhu)子。下述(shu)作為參考，反相(xiang)色譜柱(zhu)(zhu)的(de)一(yi)些(xie)相(xiang)互作用(yong)。

相互作用的(de)類型(xing)：

◆疏水性相互作用

疏(shu)水性高(gao)(gao)的物質之間會有相(xiang)互牽引作用，與(yu)相(xiang)似相(xiang)溶道理一樣，填料結合(he)基團的碳鏈(lian)（烷基鏈(lian)）越(yue)長疏(shu)水性越(yue)高(gao)(gao)。

◆離(li)子性相互作(zuo)用

在反相分析(xi)中，弱酸性(xing)的(de)硅醇基能與堿性(xing)化(hua)合(he)物(wu)結合(he)，與酸性(xing)化(hua)合(he)物(wu)會(hui)發生(sheng)排斥，會(hui)對(dui)峰型及保(bao)留時間有(you)影(ying)響。更適合(he)使用端基封尾(wei)處理的(de)柱子或者調節溶劑的(de) PH 值，抑制這種(zhong)作(zuo)用。

◆氫鍵

氫原(yuan)(yuan)子(zi)(zi)易與電負性高的原(yuan)(yuan)子(zi)(zi)發生結合，如(ru)與氧、氮、硫、鹵素以及芳香環的 π 電子(zi)(zi)等作(zuo)用。

◆π 電子相互作(zuo)用

像(xiang)苯環這類具有(you) π 電(dian)子結構的(de)(de)化合物，相互(hu)之間會有(you)電(dian)子吸引作用(yong)。像(xiang)苯基柱這類具 π 電(dian)子作用(yong)的(de)(de)柱子，對(dui)于目標物的(de)(de) π 電(dian)子具有(you)選擇(ze)性，通過此相互(hu)作用(yong)起到分離(li)效果。

◆金屬(shu)配位吸附(fu)

填充(chong)劑(ji)硅(gui)膠基質內會(hui)含(han)有部分殘留的(de)金屬，故(gu)易會(hui)引起配位(wei)化(hua)合物的(de)吸(xi)附現(xian)象。而且，解(jie)離(li)的(de)硅(gui)醇基與(yu)金屬離(li)子一旦發生(sheng)配位(wei)，會(hui)發生(sheng)峰(feng)拖尾或者目的(de)成分不能被洗脫(tuo)的(de)狀況。

選擇方法七：色(se)譜柱接頭形式

HPLC 色譜柱(zhu)(zhu)的接(jie)頭根據廠家的不同也(ye)會有不同。一般分析色譜柱(zhu)(zhu)是 1/16 英寸外徑的管子使用螺絲(si)進(jin)行連(lian)(lian)接(jie)，若連(lian)(lian)接(jie)不同的接(jie)口，較易產生死(si)體(ti)積與漏液現(xian)象。

特別(bie)對于(yu)不銹鋼的(de)配管等，需用(yong)套圈固定管子，就必須選擇(ze)對應的(de)接口形式(shi)。

接(jie)口(kou)形式和螺距(ju)有英寸(cun)螺距(ju)和毫米螺距(ju)兩種。一(yi)般 Waters 接(jie)口(kou)型(xing)使用比較普遍。無(wu)論是 HPLC 或 UHPLC，通過選擇(ze)適當的(de)(de)色(se)譜柱接(jie)口(kou)形式，InertSustain 以及 Inertsil 的(de)(de)性能能夠充(chong)分的(de)(de)發揮（標準接(jie)口(kou)為(wei) Waters 接(jie)口(kou)型(xing)）。

選擇方法(fa)八：經(jing)常使用的色譜柱規(gui)格(ge)

◆HPLC 分析

5μm, 150×4.6mm I.D.

5μm, 250×4.6mm I.D.

◆UHPLC, LC/MS 分(fen)析(xi)

2μm, 50×2.1mm I.D.

2μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 75×2.1mm I.D.

◆LC/MS 分析

3μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 150×2.1mm I.D.

5μm, 150×2.1mm I.D